細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物威脅著人類健康,  全球每年因食品沙門氏菌污染而患病的有數(shù)百萬人,  機(jī)會(huì)致病真菌新生隱球菌每年導(dǎo)致數(shù)十萬人死亡,  病毒造成全球近 700 萬人喪生。準(zhǔn)確鑒別致病微生物是發(fā)現(xiàn)和防治食品安全危害和重大傳染病的重要先決條件。目前通用的病原微生物檢測(cè)方法基于核酸擴(kuò)增,  食品的基質(zhì)復(fù)雜且種類不一,  如何從食物樣本中快速、高效地提取病原微生物核酸是亟需解決的技術(shù)挑戰(zhàn),  已成為核酸快速檢測(cè)的限速環(huán)節(jié)。微生物核酸通常包裹于堅(jiān)固的細(xì)胞壁內(nèi),  細(xì)菌細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖,  革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖含量較少(僅 1~2 層),  而革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁由厚達(dá) 40~80  nm 的多層肽聚糖(15~50 層)組成,  其細(xì)胞壁厚度也遠(yuǎn)高于革蘭氏陰性細(xì)菌。真菌細(xì)胞壁由多糖和蛋白質(zhì)組成,  主要包括幾丁質(zhì)、葡聚糖和甘露聚糖/半乳甘露聚糖。基于此,  細(xì)菌和真菌核酸提取相對(duì)困難。病毒是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的非細(xì)胞型微生物,  主要由蛋白質(zhì)外殼和核酸組成。病毒的蛋白質(zhì)外殼稱為核衣殼,  由殼粒組成,  對(duì)病毒核酸起保護(hù)作用,  且介導(dǎo)病毒核酸侵入宿主細(xì)胞。病毒蛋白外殼相對(duì)脆弱,  核酸提取過程較為容易。

核酸提取微流控芯片

微流控芯片可在微米、毫米尺度完成分離、轉(zhuǎn)移、萃取、吸附、洗滌等復(fù)雜的單元操作,  實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)和核酸等復(fù)雜分子的分離和檢測(cè)。基于液滴的微流體技術(shù)有高通量、并行化、集成化的優(yōu)勢(shì),  已被廣泛用于生物檢測(cè), 如癌癥生物標(biāo)志物、細(xì)胞外分泌物等。為構(gòu)建適用于現(xiàn)場(chǎng)化的病原微生物檢測(cè)方法,  微流控芯片的自動(dòng)化、集成化及高通量過程提供了良好的改進(jìn)手段,  其設(shè)計(jì)原理大致如所示。目前,  已有多種核酸提取方法與微流控裝置組合使用,  可簡(jiǎn)化操作過程、減少試劑用量、提高檢測(cè)效率

微型磁珠微流控芯片

OH 等開發(fā)了一種全集成的自動(dòng)離心微流控裝置用于多重食源性病原體檢測(cè),  該檢測(cè)裝置使用微型珠子輔助提取 DNA,  提高了樣品的處理能力。將磁珠與微芯片相結(jié)合對(duì)水傳播病原體進(jìn)行 DNA 提取和檢測(cè),  該方法第一次使用嵌入式振動(dòng)裝置在 180  Hz 下對(duì)芯片上細(xì)胞進(jìn)行裂解, 裂解效率約為 97%。裂解釋放后的 DNA 會(huì)與殼聚糖涂覆的納米磁珠結(jié)合形成復(fù)合物,  再用洗滌液除去細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)等得高純 DNA,  提取效率接近 100%。與 TRIzol 法相比(2 h),  該系統(tǒng)提取僅需 15 min 且 DNA 質(zhì)量相近,  并且具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短和高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。GOWDA 等組合磁珠和硅基研磨珠,  將核酸提取過程設(shè)置于碟式芯片上,  完成從核酸提取、純化、擴(kuò)增的全流程僅需 1 h。利用磁珠法制備的微流控芯片,  其裂解、抽提、純化、檢測(cè)等步驟均可集成一體,  具有較大應(yīng)用空間,  但該過程不易滿足高通量檢測(cè)要求。

超聲波微流控芯片

超聲波微流控芯片利用表面聲波振蕩驅(qū)動(dòng)含細(xì)胞微滴碰撞芯片表面來破壞細(xì)胞膜的原理,  釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸。ZHANG 等開發(fā)了一種可在 1  min 內(nèi)從血清樣品提取 HBV 和 HIV 病毒核酸的微流控芯片,  該芯片配備壓力驅(qū)動(dòng)彈性膜閥,  將微流控通道分成多個(gè)室(試劑儲(chǔ)存室、反應(yīng)室),  其核心提取部件為超聲波細(xì)胞裂解和基于二氧化硅膜的固相萃取。該方法效率高,  樣品消耗低, 可在醫(yī)院或生物實(shí)驗(yàn)室中預(yù)處理少量測(cè)試樣本。 超聲波微流控芯片利用表面聲波振蕩驅(qū)動(dòng)含細(xì)胞微滴碰撞芯片表面來破壞細(xì)胞膜的原理,  釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸。ZHANG 等開發(fā)了一種可在 1  min 內(nèi)從血清樣品提取 HBV 和 HIV 病毒核酸的微流控芯片,  該芯片配備壓力驅(qū)動(dòng)彈性膜閥,  將微流控通道分成多個(gè)室(試劑儲(chǔ)存室、反應(yīng)室),  其核心提取部件為超聲波細(xì)胞裂解和基于二氧化硅膜的固相萃取。該方法效率高,  樣品消耗低, 可在醫(yī)院或生物實(shí)驗(yàn)室中預(yù)處理少量測(cè)試樣本。

總結(jié)

雖然分子檢測(cè)技術(shù)飛速發(fā)展,  多種核酸擴(kuò)增技術(shù)日益成熟,  但核酸快速提取技術(shù)相對(duì)落后,  已成為病原微生物現(xiàn)場(chǎng)化檢測(cè)亟需解決的痛點(diǎn)問題。病原微生物的核酸提取過程,  實(shí)質(zhì)上是將細(xì)菌、真菌、病毒的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或蛋白質(zhì)外殼破碎,  使其內(nèi)的核酸釋放且收集純化的過程。本文從病原微生物微觀結(jié)構(gòu)著眼,  概述了病原微生物細(xì)胞裂解、核酸提取、核酸純化等全過程大致發(fā)展趨勢(shì),  總結(jié)了快速化提取病原微生物核酸的創(chuàng)新方法及其適用范圍。物理裂解法依賴超聲波、機(jī)械剪切力等相關(guān)設(shè)備,  且得率相對(duì)低,  成本較高;  化學(xué)裂解法快速高效,  但對(duì)核酸損傷較大,  不利于精確核酸分析;  酶法裂解特異性強(qiáng),  獲取核酸質(zhì)量和得率高,  但消耗時(shí)間較長(zhǎng)。固相萃取快速高效、性價(jià)比高,  是應(yīng)用潛力最大的核酸純化方式之一,  其中纖維素紙基法具有代表性。綜上所述,  病原菌核酸快速提取方法未來可能有三大突破方向。第一,  開發(fā)高親和力吸附核酸的新型載體(如凹凸捧土),  綜合各種裂解方法的優(yōu)勢(shì),  組合創(chuàng)新成為優(yōu)質(zhì)高效方法。本團(tuán)隊(duì)融裂解、提取和純化三過程為一體,  正研發(fā)一種集成堿熱裂解和固相萃取相結(jié)合的快速提取方法,  實(shí)現(xiàn)一步法高效核酸提取, 現(xiàn)已完成了相關(guān)驗(yàn)證和配套提取裝置的研發(fā)(待發(fā)表)。第二,  根據(jù)食品基質(zhì)的來源或后續(xù)核酸擴(kuò)增方法的不同,  優(yōu)化設(shè)計(jì)出針對(duì)性核酸提取方法。例如,  植物基質(zhì)食品采用裂解條件相對(duì)劇烈的方法,  而動(dòng)物性食品采用相對(duì)溫和的提取方法。PCR 選用核酸純度較高的方法,  而 LAMP 用粗提核酸即可。第三,  在上述提取方法研究的基礎(chǔ)上,  開發(fā)更為精巧微流控芯片,  進(jìn)一步降低試劑消耗,  提升核酸提取的樣本通量,  增加提取過程的自動(dòng)化程度,  未來在病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域中有巨大潛力。

4. 采用微流控制備脂質(zhì)體納米粒的優(yōu)勢(shì)

脂質(zhì)體納米粒LNP的傳統(tǒng)制備方法包括沉淀法，乳化法，溶劑蒸發(fā)及超聲波處理等方法，但是傳統(tǒng)制備方法存在粒徑分布廣和批間重復(fù)性差的問題，對(duì)藥物開發(fā)的臨床試驗(yàn)和生產(chǎn)具有很大影響。而微流控技術(shù)是作為制備納米脂質(zhì)體的因?yàn)榫途哂幸韵聝?yōu)勢(shì)而引起人們的極大關(guān)注

采用微流控制備脂質(zhì)體納米粒的優(yōu)勢(shì)包括：

? 縮短混合時(shí)間

? 提高均一性

? 單分散性高（PDI低于0.2）

? 高通量和連續(xù)生產(chǎn)

? 納米顆粒生產(chǎn)的集成和自動(dòng)化

? 通過精確的流速控制，可實(shí)現(xiàn)多種粒徑的單分散納米顆粒

? 多次制備的重復(fù)性好

? 使用同一套流量控制系統(tǒng)合成小體積（μL）和大體積（L）的脂質(zhì)體納米粒

5、影響脂質(zhì)體納米粒合成的因素

大部分納米脂質(zhì)體應(yīng)用都用于抗癌藥物，mRNA，siRNA等包封。納米顆粒的大小決定包封分子數(shù)量，并影響LNP 與細(xì)胞組織的相互作用及釋放動(dòng)力學(xué)，粒徑的微小差異都可以引起藥物遞送效率的極大不同。此外，粒徑大小分布也會(huì)引起包封和釋放效率的不同，因此精確控制納米脂質(zhì)體顆粒的大小和具有低的粒徑分布是及其重要，微流控技術(shù)可以精確控制流體的大小和兩相的比例，從而精確控制粒徑的大小和分布。

合成脂質(zhì)體納米粒非常重要部分是實(shí)現(xiàn)有機(jī)相和水相的快速混合，混合的效率和均一性越好，獲得脂質(zhì)體納米粒的大小和分布越精確。

目前常采用兩種類型的微流控芯片進(jìn)行納米脂質(zhì)體的合成，一種是魚骨形芯片，一種是流動(dòng)聚焦型芯片，這兩種芯片可以實(shí)現(xiàn)有機(jī)相和水相的控制和快速混合，乙醇相的快速稀釋可獲得小粒徑的LNP。

納米脂質(zhì)體顆粒的大小不僅取決于所用芯片，而且受脂質(zhì)體溶液組成（類型，分子量大小，濃度等）和水溶液組成（pH，鹽濃度，表面活性劑）以及兩相流速比（FRR）及總流速（TFR）的影響。

FRR( flow rate ratio)是指水相流速和有機(jī)相流速的比，是制備LNP 重要的參數(shù)，依據(jù)經(jīng)驗(yàn)較高的流速比會(huì)合成較小的納米脂質(zhì)體，尤其采用流動(dòng)聚焦芯片時(shí)，FRR影響更大，而使用人字形芯片是，FRR 影響較小。

TFR（total flow rate）是指水相和有機(jī)相和流速之合，當(dāng)使用流動(dòng)聚焦芯片是，TFR 影響較小，而使用魚骨形芯片時(shí)，提高TFR會(huì)降低混合時(shí)間，從而使得LNP顆粒變小。

有機(jī)相中脂類的組成及脂類的濃度也是覺得脂質(zhì)體顆粒大小的重要因素，一般情況下，高的脂類濃度會(huì)合成較小的LNP。其他影響因素還包括pH值，溫度，緩沖液組成等。

6、脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)組成

脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)需要流量控制系統(tǒng)和微流控芯片，具體包括2通道的OB1 壓力驅(qū)動(dòng)的流量控制器，2個(gè)流量傳感器，2個(gè)儲(chǔ)液管以及微流控芯片。采用魚骨形微流控芯片和流動(dòng)聚焦微流控芯片的具體連接如下圖：

此脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)的原理是，連接至壓力源的壓力控制器提供一個(gè)穩(wěn)定的壓力數(shù)值，通過管線為密封儲(chǔ)液管施加固定的壓力，從而將儲(chǔ)液管中的液體穩(wěn)定的輸出，并經(jīng)過流量傳感器，流量傳感器測(cè)定流量并反饋給壓力控制器，從而達(dá)到精確流量控制的目的，隨后流體被穩(wěn)定、精確的輸送到微流控芯片中，具體參數(shù)可通過電腦上的軟件進(jìn)行控制設(shè)定。2通道的壓力控制器分別控制含脂質(zhì)的乙醇相和水相溶液，兩相溶液可以分別調(diào)節(jié)流速，經(jīng)過流量傳感器和阻尼器后在微流控芯片中混合，從而合成納米脂質(zhì)體，具體可以通過調(diào)節(jié)乙醇相及水相的流速，流速比及總流速，獲得固定粒徑大小的納米脂質(zhì)體

與注射泵相比，此系統(tǒng)中的壓力驅(qū)動(dòng)控制器具有壓力穩(wěn)定性好，流量精確度高，無脈動(dòng)，穩(wěn)定時(shí)間短，相應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，是微流控系統(tǒng)中性能最佳的流量控制器，是制備納米脂質(zhì)體顆粒的理想用泵。

此微流控系統(tǒng)是專為研究者設(shè)計(jì)的脂質(zhì)體納米粒合成系統(tǒng)，即便沒有微流控和納米脂質(zhì)體合成經(jīng)驗(yàn)的研究者可以輕松合成納米脂質(zhì)體。依據(jù)簡(jiǎn)單直觀的操作指南可以精確控制納米脂質(zhì)體合成的參數(shù)，以100ul/min-30ml/min流速連續(xù)合成脂質(zhì)體，可獲得60-250nm高分散性的納米顆粒。此系統(tǒng)可以根據(jù)客戶需求合成脂質(zhì)體和固體脂質(zhì)體粒以及其他類型的納米顆粒。